۲۲ آذر , ۱۳۹۵

خالص سازی پلاسمید

۰۱_۱۲_modopf
محتوای جدول

 به گزارش بیوکمپ مرکز تخصصی ژنتیک و بیوانفورماتیک در ایران؛ خالص سازی پلاسمید تکنیکی است که به منظور جداسازی و خالص نمودنDNAپلاسمیدی از DNAژنومی ،پروتئینها،ریبوزوم ها ، ودیواره سلولی باکتریایی بکار میرود . پلاسمید ،DNAدو رشته ای ، حلقوی ، کوچک میباشد که به عنوانحامل برای مولکول های  DNAخاص بکار می رود. زمانی که از طریق ترانسفورمیشن به یک ارگانیسم میزبان عرضهمیشود ،یک پلاسمید همانندسازی خواهد کرد، و نسخه های متعدد از قطعه  DNAتحت مطالعه به وجود می آیند.این فیلم به توصیف مرحله به مرحله چگونگی روند خالص سازی پلاسمید میپردازد .خالص سازی پلاسمید دارای سه مرحله اساسی میباشد : رشد محیط کشت باکتریایی ، برداشت و لیز کردن باکتری ،و خالص سازی  DNAپلاسمیدی .اینفیلم توضیح میدهد که پلاسمید میتواند در هر مرحله از پروتکل یافت شود و به بررسی کمی و کیفی  DNAپلاسمیدی بااسپکتروفتومتر و ژل الکتروفورز میپردازد .انواع روش های متفاوت برای خالص سازی پلاسمید موجود میباشند که به منظوردستیابی به بازده و تعداد نسخه ها و حجم محیط کشت باکتریایی مطلوب سازمان دهی شده اند

پلازمید ها حلقوی ،کروموموزم اضافی˛مولکول های DNAای هستند که در زیسهت شناسهی مولکهولی نهها وه نهوا حامل یا وکتور ورای قطعه ای از DNAخها مهل مهی کننهد از وهاکتری هها وهرای همانندسهازی DNAاسهتااد مهی شود پس DNAمهورد نرهر شهما وه تولیهد انوهو مهی رسهد فر یندهایی که وه وسهیل محققهی چلاسهمید ر از واکتریهها ودست می ورند را خال سازی پلاسمید گویند ک در ای فیلم توضیح داد خواد شد وطور شکار خال سازیلازمید شامل تخلی پلازمیدها میشود اما ای دقیقها وه چه معنها اسهت وهرای خهال سهازی پلازمید واید نها را از کروموزوم و پروتئی واکتریایی˛ غشاء واکتریایی و ریووزوم واکتریایی جدا شوند اگرچ کیت های مختلف زیادی ورای خال سازی پلازمید وجود دارند˛ک اصول پای ای همه نهها یکسها اسهت اوتدا کلنهی واکتریهایی در محهیط کشهت مناسه که دارای انتهی ویوتیه مهی واشهد رشهد مهی یاوهد وه لطهف مقهاوم وه نتهی ویوتی کد شد توسط پلازمید تنها واکتری هایی در محیط کشت رشد می کننهد که ایه پلازمیهد را دارا واشهند واکتریهها ورداشت و تحت PHوالا لیز می شوند PHخنثی شد است ˛نم اضاف شد و وعد مخلوط را رام میچرخانیم تا مهواد زائد و DNAنومی حذف گردند صار سلولی خنثی و ی ستو (فیلتر)سیلیکا اضاف می شود DNAپلازمید ور ای واور است که وها مکانیسهمی که و تعویض یونی گویند و ستو چسوید است جایی ک DNAنیونی قوی و واسط پل های نمکهی وه شهار مناهی ستو متصل می شود وقی مواد صار سلولی مانند پروتئی ها توسط وافر غلهیر نکمهی از سهتو وهور مهی کنهد در خر پلازمید خا شد وا از وی رفت پل هی نمکی توسط وافر نمکی رقیق از ستو خاج می شود

برای این رویه باید روپوش،دستکش یکبار مصرف و عینک محافظ پوشید.کشت باکتریایی  که ترنسفورم میشود با DNA پلاسمید مطلوب،باید در مدت یک شب در محیط های کشت به همراه انتی بیوتیک مناسب در ۳۷ درجه در انکوباتور شیک کننده رشد کند.در روز بعد کشت باکتریها با عمل سانتریفیوژ رسوب میکند و مایع رویی را دور میریزیم. باقی مانده رسوب  در بافر لیزکننده حل میشود.با یکبار حل شدن ،باکتریها میتوانند منتقل شوند به تیوب کوچک جاییکه بافر لیز کننده اضافه میشود.بافر لیزکننده PH بالا دارد و حاوی دترجنت است همانند سدیم دودسیل سولفات،که غشا باکتریایی را تخریب میکند،بنابراین باکتریها تخریب میشوند.محلول کدر میشود با اضافه کردن بافر لیزکنده و بعد مخلوط میشود و رنگ محلول شفاف تر میشود.مخلوط ما نباید ورتکس شود بخاطر شکستن یا جدا شدن قسمتی از DNA ژنومی که میتواند باعث الودگی خالص سازی DNA پلاسمید شود.سپس بافر خنثی  کننده اضافه میشود به منظور خنثی کردن شرایط قلیایی و تنظیم PH.DNA ژنومی را ارام تکان میدهیم  همچنین باندهای پروتئین رسوب خواهد کرد درحالیکه DNA   پلاسمید در محلول مانده است.یکبار دیگر ورتکس نکنید پلاسمید شما عاری از الودگی DNA ژنومی باشد

سپس مخلوط سانتریفیوژ می شود و DNAژنومی و رسوب پروتئین پلت می شود. مایع رویی شامل DNAپلاسمید و نیز پروتئین های محلول می باشد. این مایع رویی از طریق دکنتینگ (با سرازیر کردن) در ستون قرار می گیرد. دکنتینگ یک نام فانتزی برای ریختن یا پیپت کردن است. رسوب را می توانیم دور بریزیم. در مرحله بعد، بافر شستشو که غلظت نمکش بالاست از ستون عبور می کند در حالی که DNAمحدود به سیلیس باقی می ماند. با تکرار کردن مراحل شستشو، بافر با غلظت نمک بالا اندونوکلئازها، ،RNAپروتئین ها، رنگ ها و ناخالصی های با وزن مولکولی پایین را حذف می کند. جریان رد شده از مراحل شستشو را باید دور بریزیم. بعد از مرحله ی آخر شستشو حتما فیلتر را کاملا خشک می کنیم تا هیچ بافری در آن باقی نمانده باشد. DNAپلاسمید هنوز به فیلتر چسبیده است و با مایع استریل یا بافر شستشو شسته می شود. ،DNAبرای استفاده ی فوری در طیف وسیعی از کاربردها آماده و در دسترس است. تعداد زیادی از روش ها به منظور تصدیق خلوص پلاسمیدها بعد از خالص سازی وجود دارند. طیف سنج می تواند به منظور مقایسه جذب در طول موج های مختلف جهت تعیین غلظت DNAپلاسمید استفاده شود. بررسی ژل آگاروز از پلاسمید خالص می تواند تعیین کند که پلاسمید به اندازه ی صحیح و بدون آلودگی است. این مرحله تضمین می کند که هیچ آلودگی DNAژنومی وجود ندارد و پلاسمید در باکتری تغییر نکرده است.


محقق: زهرا شانی

2 دیدگاه

دیدگاهتان را بنویسید

آدرس ایمیل شما منتشر نخواهد شد. فیلدهای مورد نیاز با * مشخص شده است

نوشتن دیدگاه

مقالات مرتبط